化控种衣剂对低温胁迫下大豆幼苗的调控机理

冯乃杰郑殿峰

（黑龙江八一农垦大学植物科技学院）

摘要：本试验通过人工低温处理，探讨了化控种衣剂和常规种衣剂包衣后的大豆幼苗几个耐冷性生理指标的差异。并对逆境下丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、可溶性糖等指标进行了测定分析。结果表明，低温胁迫后，化控种衣剂处理的POD、SOD的活性和可溶性糖的含量均高于对照，MDA的活性低于对照，并且曲线变化平缓。从植物内源激素的变化来看，低温胁迫使大豆内源激素系统中各种激素又达到了新的动态平衡，激素含量的变化利于大豆抵御低温胁迫，说明了化控种衣剂提高了大豆幼苗的抗寒性。

关键词：大豆化控种衣剂低温胁迫保护酶系统植物内源激素

0 前言

研究植株的冷害及其冷害机理等问题在理论及实践上都具有重要的意义[1]。现代有关植物抗寒性研究表明，在低温胁迫下，植物出现的伤害与某些毒害物质如氧自由基和过氧化物在低温下大量积累而引起膜质过氧化作用增强有关，那么，低温胁迫逆境中，植物必然要发生相应的适应性变化或迅速的防卫反应，才能提高抗寒力，避免冻害[2]。深入研究低温胁迫对大豆幼苗的生理伤害机理，并采用适当措施预防以减轻低温逆境所造成的危害，对大豆的生产有着巨大的意义。在抗寒性的研究方面，低温导致SOD活性下降及膜脂过氧化加强，已在水稻、黄瓜、玉米等作物和蔬菜上得到证实[3-5]。关于在大豆幼苗期给予低温胁迫，探讨化控技术对膜质过氧化和保护酶系统的作用机理，及其植物内源激素的变化规律，尚未见过系统报道，本文针对这方面进行研究，目的在于为北方大豆早播高产提供适用的栽培技术和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种为垦农4号（亚有限结荚习性，当地主栽中熟品种）。应用的种衣剂为黑龙江八一农垦大学生产的ND牌大豆常规种衣剂（用ND表示）和黑龙江八一农垦大学植物科技学院化控室研制的新型化控种衣剂（用HK表示）。种衣剂用量均为种子重量的1.5%。

1.2试验设计：

本试验于2002年6月进行，采用盆栽方法，盆栽土壤为轻壤土，肥力中等。以化控种衣剂（HK）拌种为处理，以常规种衣剂（ND）拌种为对照，分别在播种前进行拌种。处理和对照各播72盆，每盆播20粒种子，苗期根据水分状况适时浇水。逆境处理是在真叶刚展平时把处理与对照均置于4℃下进行低温处理， 48小时后结束，在低温处理期间和低温解除后的时间内定时取样。在结果与分析中均以C表示低温胁迫，以R表示恢复常温。

1.3测定项目和方法

1.3.1取样方法：

分别于处理和对照盆中在低温处理0小时、12小时、24小时、48小时、低温恢复12小时、24小时、48小时进行取样。每次取生长发育一致的植株15株，先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，用吸水纸擦干。把处理和对照的子叶、根系、真叶分开包装，立即放入液氮中速冻20min，然后置于—20℃低温冰柜中冷冻待测。

1.3.2 过氧化物酶（POD）活性的测定

酶液制备：称1.0g鲜样，分次加入3ml62.5mmol/l PH7.8的PBS，低温下研磨成匀浆，在15000×g、4℃下离心20min。取上清液于4℃下保存备用。

测定方法：取适量酶液，加3ml反应混合液（PBS磷酸盐缓冲液+30%双氧水+愈创木酚），并同时启动秒表记录时间，定时记录吸光值，比色波长为470nm。

1.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

酶液制备同上。

测定方法：酶反应体系加样次序：PBS缓冲液、核黄素液、蛋氨酸、EDTA（乙二胺四乙酸）液、酶液、NBT（氮蓝四唑）。以不加酶液的试管为最大光化还原管，用缓冲液作空白管，然后将各管在4000lux下反应25min进行光化还原。测定反应液在560nm处的OD值。

1.3.4 丙二醛和可溶性糖含量的测定

酶液制备同上。

测定方法：取酶液2.0ml,加入2.0mlTCA（三氯乙酸）混匀，盖上橡皮塞煮沸15min后快速冷却，4000×g离心20min，以10%TCA为参比，取上清液在450nm、532nm、600nm处测定OD值。根据下面公式先计算出提取液中丙二醛和可溶性糖的浓度，然后计算出每克样品中丙二醛和可溶性糖的含量。

C₁ (mmol/l)=11.71D₄₅₀ (C1 —提取液中可溶性糖浓度)

C₂ (μmol/l)=(6.45D₅₃₂—D₆₀₀)—0.56D₄₅₀(C2 —提取液中丙二醛浓度)

1.3.5 植物内源激素的测定

参考何钟佩书（1993年编）。

2 结果与分析

2.1化控种衣剂对逆境中大豆某些生理指标的影响

2.1.1丙二醛含量

图1 根系中丙二醛(MDA)活性的变化动态

图2 子叶中丙二醛(MDA)活性的变化动态

图3 真叶中丙二醛(MDA)活性的变化动态

丙二醛是生物膜系统脂质过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度（刘祖祺，1994；田晓莉等，1998）。从图1—图3可以看出，苗期低温胁迫后后大豆幼苗中丙二醛含量发生了变化，在根系、子叶、真叶中变化趋势相似，但变化幅度不同。化控种衣剂处理的丙二醛含量低，并且曲线变化平缓。根系是在低温胁迫12小时丙二醛含量达到最大值，此时与低温处理0小时相比，ND含量提高了13.75%，HK处理提高了5.65%；子叶是在低温胁迫24小时含量达到最大值，此时与低温处理0小时相比，ND含量提高了33.56%，HK处理提高了25.09%；真叶是在低温胁迫48小时含量达到最大值，此时与低温处理0小时相比，ND含量提高了38.35%，HK处理提高了16.08%。从几个部位比较来看，ND的真叶受到的伤害最大，HK的根系受到的伤害最小。无论是根系、子叶还是真叶，化控处理丙二醛含量的增加幅度较小，因此可以看出，低温对化控种衣剂处理的幼苗影响较小。

2.1.2超氧化物歧化酶（SOD）

图4 根系中超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化动态

图5 子叶中超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化动态

图6 真叶中超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化动态

SOD酶能消除逆境中生成的氧自由基，SOD酶是防护氧自由基对细胞膜系统伤害的保护酶（张学明等，1998）。低温胁迫SOD酶的活性降低，而在低温解除后活性又有所恢复。从图4—图6 可以看出，根系、子叶、真叶的变化趋势是相同的，但变化幅度不同。根系是在低温胁迫48小时SOD活性降低到最低值，此时与低温处理0小时相比，ND含量降低了41.86%，HK处理降低了26.09%；子叶是在低温胁迫24小时SOD活性降低到最低值，此时与低温处理0小时相比，ND含量降低了44.83%，HK处理降低了18.21%；真叶是在低温胁迫48小时SOD活性降低到最低值，此时与低温处理0小时相比，ND含量降低了40.89%，HK处理降低了25.48%。在整个过程中，ND的SOD活性下降的幅度大，HK的SOD活性下降的幅度小。化控处理的SOD活性均高于对照，这说明了低温处理后HK处理对活性氧的清除能力强，应用化控种衣剂减轻了对幼苗的伤害。

2.1.3 过氧化物酶（POD）

图7 根系中过氧化物酶(POD)活性的变化动态

图8 子叶中过氧化物酶(POD)活性的变化动态

图9 真叶中过氧化物酶(POD)活性的变化动态

过氧化物酶在植物生长发育过程中起着重要的作用，与植物的呼吸作用、光合作用及吲哚乙酸的氧化等有关，在代谢中调控IAA含量水平，免除机体内产生过氧化氢的毒害作用（刘祖祺，1994）。从图7—图9可以看出，苗期根系、子叶和真叶的过氧化物酶在低温胁迫中的变化趋势是一致的，均表现为在低温胁迫12小时时，POD活性明显增加，在低温胁迫过程中其活性逐渐下降，而低温解除后活性又有所增加。从变化总趋势来看，都是化控种衣剂处理的POD活性高，处理和对照的差异在子叶和真叶中较明显，因此从POD活性来看，化控种衣剂处理的对逆境的抵抗能力好于对照。

2.1.4可溶性糖含量

图10 根系中可溶性糖含量的变化动态

图11 子叶中可溶性糖含量的变化动态

图12 真叶中可溶性糖含量的变化动态

从图10—图12 可以看出，从总的趋势来看，HK处理的可溶性糖在低温胁迫时含量高。从低温胁迫到低温解除的过程中，子叶和根系中变化幅度大，而真叶中变化幅度小。在根系中低温胁迫12小时HK处理可溶性糖含量达最大值，此时比ND提高了88.79%，真叶中低温胁迫48小时HK处理可溶性糖含量达最大值，此时比ND提高了19.21%。HK处理子叶中在24小时达到最大值（比HK的C0提高了37.38%），而ND子叶在低温胁迫48小时才达到最大值（此时比ND的C0提高了34%），由此可以看出，HK处理使根系、子叶、真叶中可溶性糖含量在低温处理后有不同程度的提高。可溶性糖含量提高后，渗透势降低，对低温逆境的适应性强。

综上所述，低温胁迫后，HK处理的POD、SOD的活性和可溶性糖的含量均高于对照，MDA的活性低于对照，并且曲线变化平缓。综合这几方面的因素可知，HK处理能够减轻膜质过氧化程度。因此推断，经化控种衣剂处理的大豆，抗寒性明显提高。

2.2 化控种衣剂对逆境中大豆幼苗内源激素含量的影响

2.2.1根系中内源激素含量的动态变化

图13 低温胁迫对大豆苗期根系内源IAA含量的影响

如图13所示，在低温胁迫下，根系中IAA含量发生了大的波动，出现了两个高峰，从整个过程来看，HK处理的IAA含量除在低温恢复24小时略低以外，其余时间含量均高于ND，低温胁迫12小时和48小时时分别为对照的3.35倍和8.42倍。

图14 低温胁迫对大豆苗期根系内源CTKs含量的影响

如图14所示，在低温胁迫后，CTKs含量先下降，然后又升高。从整体来看，HK处理的明显高于对照，在低温胁迫48小时化控处理达最大值，含量为对照的5.54倍。

图15 低温胁迫对大豆苗期根系内源GAs含量的影响

如图15所示，在低温胁迫后，处理和对照在低温胁迫期间GAs含量略有下降，而低温解除后含量又出现大的波动，处理和对照分别在恢复常温的24小时和12小时含量达到最大值，在解除低温48小时含量又恢复到原来的水平。

图16 低温胁迫对大豆苗期根系内源ABA含量的影响

如图16所示，在低温胁迫后，ABA含量变化与前面几种激素相似，总的趋势是低温使脱落酸含量增加，低温解除后含量下降。经HK处理的曲线变化比较平缓。低温解除48小时其含量又恢复到原来的水平。在低温胁迫48小时处理和对照的ABA含量达到最大值，对照含量是处理的2.1倍。

综上所述，在低温胁迫下，处理和对照大豆根系内源激素含量都发生了大的变化。比较可知，化控处理的根系中IAA和CTKs含量均有显著的提高；ABA含量显著低于对照，这说明了HK处理后幼苗对低温反应迟钝。GAs含量略低于对照，多数研究表明，GAs的含量与植物的抗寒性成负相关关系，推测这可能是化控处理使大豆抗寒性提高的原因之一。

2.2.2子叶中内源激素含量的动态变化

图17 低温胁迫对大豆苗期子叶内源IAA含量的影响

从图17可以看出，低温处理后，大豆苗期子叶内源IAA含量发生了较大的变化。从总趋势来看，子叶中IAA含量变化呈双峰曲线，除低温胁迫24小时和低温解除12小时外，HK处理的IAA含量要高于ND对照。

图18 低温胁迫对大豆苗期子叶内源CTKs含量的影响

从图18可见，低温胁迫后大豆幼苗子叶中内源CTKs含量略有下降，低温解除24小时后，含量大幅度上升。处理和对照的差异不大。低温处理时，除24小时处理的略低于对照外，其它时间处理的CTKs含量略高于对照。低温解除后，HK处理的CTKs含量低于对照。

图19 低温胁迫对大豆苗期子叶内源GAs含量的影响

从图19可见，低温处理使大豆苗期子叶内源GAs含量发生了变化，但低温处理期间，处理和对照表现明显不同，HK处理的含量是先降后升，而ND对照的含量恰恰相反。从总体上看，低温胁迫时，HK的GAs含量低于ND，低温解除后，HK的GAs含量高于ND。

图20 低温胁迫对大豆苗期子叶内源ABA含量的影响

从图20可见，低温胁迫下大豆苗期子叶内源ABA含量升高，低温解除后使ABA含量又得到恢复。整个过程来看，HK的含量低于ND。

综上所述，苗期低温后，子叶中内源激素系统中各种激素含量均发生了变化。但子叶与根系相比较，子叶中各种激素的变化不如根系中明显。处理和对照的变化趋势相似。与ND相比，低温胁迫后HK的IAA和CTKs含量有所增加，ABA和GAs含量有所减少。

2.2.3真叶中内源激素含量的动态变化

图21 低温胁迫对大豆苗期真叶内源IAA含量的影响

从图21可见，大豆苗期真叶内源IAA含量在低温胁迫到解除低温的过程中总的变化趋势是先增加后降低，最后又增加，HK与ND变化趋势相似，处理和对照在低温胁迫24小时含量达最大值，而到低温解除12小时含量下降到最小值。HK的IAA含量一直高于ND。

图22 低温胁迫对大豆苗期真叶内源CTKs含量的影响

从图22可见，大豆苗期真叶内源CTKs含量在低温胁迫时表现出几次波动，胁迫12小时含量较低，胁迫24小时含量较高，胁迫48小时含量又降到较低水平。而在恢复常温后HK处理的含量明显升高，在低温解除24小时出现峰值，此时含量为对照的3.14倍。整个过程中HK的CTKs含量普遍高于ND。

图23 低温胁迫对大豆苗期真叶内源GAs含量的影响

从图23可见，大豆苗期真叶内源GAs含量在低温胁迫时减小，而在低温解除后含量又增加。整个过程来看，低温胁迫时，HK处理的含量低，恢复温度时，HK处理的含量高。

图24 低温胁迫对大豆苗期真叶内源ABA含量的影响

从图24可见，大豆苗期真叶内源ABA含量在低温胁迫时增加，低温解除后含量在下降，在低温解除48小时恢复到接近原来的水平。整个过程中HK处理的曲线变化平稳，并且一直处于较低的水平。

综上所述，低温胁迫使真叶中各种内源激素含量发生了较大的变化。在发生低温胁迫时，HK处理的IAA、CTKs含量有增加的趋势，而GAs、ABA含量下降。在低温胁迫解除时，各种激素又恢复到原来的水平。

3 小结

(1) 通过对大豆不同部位与逆境有关指标的测定可以看出，在根系、子叶、真叶中各种指标的变化趋势是一致的。化控处理提高了过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，大豆在低温胁迫下POD、SOD的活性与对照相比下降的速度减缓，丙二醛的含量增加的幅度减小，因而可减少膜质过氧化作用对细胞的伤害。低温胁迫时化控处理可溶性糖含量增加，可为植株在低温时提供更多的能量物质，细胞的渗透势得到调节，降低了结冰点，提高了细胞的抗寒能力。

(2) 通过对植物激素的测定可以看出，低温胁迫使大豆内源激素系统中各种激素又达到了新的动态平衡。其中各种激素的变化趋势在大豆不同部位是相似的，只是在不同部位影响程度不同。HK与ND相比，低温胁迫使HK处理的IAA和CTKs含量高，而GAs和ABA含量都下降。由于IAA和CTKs是促进型激素，含量高会促进幼苗生长，GAs与植物的抗寒性成负相关，处理的含量低可表明抗寒性增强；这与前人在其它作物上的研究结论一致。ABA在低温胁迫时作为一种感受刺激的信号物质，含量低说明低温对其影响程度小。

综上所述，化控种衣剂提高了大豆幼苗的抗寒性，在北方地区推广应用将具有一定的实际意义。