1国家大豆品种区域试验精确度研究

2 磷高效大豆根系特征的生理.遗传和分子生物基础研究

3 吉林省高脂肪大豆高产栽培技术规程

4 获得双价抗虫基因大豆转化植株

5 黑龙江省垦区高油大豆生产特点与相应的栽培技术

6 大豆新品种“吉科豆5号”选育报告

7 不同基因型大豆籽粒球蛋白及其亚基组分积累规律的研究

8 大豆生长模拟模型决策支持系统（SMDV2.0）应用效果初报

9 豫豆-2511S球蛋白结构与凝胶，乳化特征关系的研究

10 大豆种间杂交新品种龙小粒豆一号的选育

11 精准农业与大豆

12 大豆杂交种研究进展

13 大豆高蛋白优异种质的改良和创新

14 “入世”后山西大豆发展对策研究

15 大豆对豆卷叶螟抗性的鉴定　

16 扁茎大豆的花序形态受光周期调控　

17 化控种衣剂对低温胁迫下大豆幼苗的调控机理

18 大豆小区种子干燥机的实验研究

19 超高产夏大豆南农88-31栽培技术研究

20 大豆质核互作雄性不育系小孢子败育的细胞形态学特征

21 外界因子对超高压杀灭枯草芽孢杆菌效果的影响

22 响应面法优化超高压杀灭食品中枯草芽孢杆菌工艺

23 应用SSR分子标记对中国东北栽培大豆遗传资源多样性评价研究

响应面法优化超高压杀灭食品中枯草芽孢杆菌工艺*

高瑀珑[1]  王允祥  武宁  江汉湖[2]

(南京农业大学食品科技学院 •南京 •卫岗•210095)

Optimum process of Bacillus subtilis of High hydrostatic pressure inactivation in food by response surface methodology

Gao Yulong  Wang Yunxiang  Wu Ning  Jiang Hanhu

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agriculture university, Nanjing, weigang, 210095)

摘要：通过外界因子对超高压杀灭枯草芽孢杆菌效果的影响研究发现：温度、压力、保压时间是灭活枯草芽孢杆菌显著影响因子。在此基础上，本研究采用响应曲面法（RSM，Response surface methodology）对主要因子压力、温度和保压时间进行了优化，结果表明杀灭6个数量级的枯草芽孢杆菌的杀菌条件，温度为：X₁=31.10～59.03℃，压力为X₂=435.23～562.21 MPa，保压时间为X₃=10.11～19.53min，优化出10组杀菌工艺参数，并且对工艺参数进行验证。

关键词：超高压，枯草芽孢杆菌，响应面法，优化， 预测

Abstract: We found that the pressure, temperature and pressure holding time are believed to be the major factors for sterilization of High hydrostatic pressure through the studies of the effects of external factors on Bacillus subtilis of High hydrostatic pressure inactivation. Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the process variables of there major factors. Result showed that the condition to sterilize Bacillus subtilis Of six log cycles such as temperature (31.10～59.03℃), pressure (435.23～562.21 MPa ), pressure holding time (10.11～19.53min ), and process parameter of ten groups were optimized, which was also verified experimentally.

Keywords: High Hydrostatic pressure; Bacillus subtilis Response surface methodology(RSM); Optimization; Predict

前言

1895年Rogar首次报道超高压可以杀灭微生物^[1]，1899年Hite^[2]首次应用高压技术来保藏食品。目前,超高压技术已成为一种有效的灭菌、消毒的物理手段^[3]，对微生物的生理和存活产生决定性的影响^[4]， 与热处理方法相比较，超高压杀菌作用均一、迅速，无大小和形状的限制，对食品的风味物质、色素等小分子物质的天然结构无影响，较多的保存食品原有的营养成分，避免热杀菌带来的异臭及异常物质的生成，很好地保持食品的原汁、原味及性状等^[5~10]。300MPa的超高压下酵母、霉菌、病毒和大多数细菌立即死亡，但对于芽孢杆菌属的芽孢则耐压，杀菌需要更高的压力，结合加热处理才更有效^[11]。

一般而言，耐热的细菌较耐压^[12]。而笔者研究发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） AS1.1731比嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothemophilus）AS1.1923更耐压。Nayakawa,A.^[13]及Sojka,B.^[14]也发现同样的现象。另外，枯草芽孢杆菌是食品中常见的污染菌，尤其在传统的发酵制品中，因此，本研究以枯草芽孢杆菌为试材。

响应曲面法（RSM）是统计设计实验技术的合成，它包括实验设计、建模、检验模型合适性、因子效应的评估、考察以及寻求因子最佳操作条件^[15~18]，近年来响应面方法已成功地应用于生物技术的许多方面，但用于优化杀菌条件的研究国内外尚未见报道。通过外界因子对超高压杀灭枯草芽孢杆菌效果的研究发现：温度、压力、保压时间是灭活枯草芽孢杆菌显著的影响因子。本文主要目的是利用响应曲面法对影响超高压灭活枯草芽孢杆菌的关键因子压力、温度、时间进行优化，建立超高压杀灭耐压性枯草芽孢杆菌AS1.1731的数学模型，以期为超高压灭菌在食品工业中的应用提供理论依据和方法。

1实验材料和方法

1.1 试剂

Milk buffer：KCl 1.10g，MgSO₄·7H₂O 0.71g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.77g，CaSO₄·2H₂O 1.00g ，CaCl₂ 0.86g，Citric acid·H₂O 2.18g，Lactose 52.00g，ddH₂O 1000ml，pH 7.0，以过滤法除菌，冷藏备用；无菌生理盐水。

1.2 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）AS1.1731，购自于中国科学院微生物所。

1.3 培养基及培养方法

固体培养基：营养肉汁琼脂（牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂1.7%）；

液体培养基：营养肉汁（牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%）；菌种经活化后，接入液体培养基，37℃，140rpm震荡培养48h。

1.4 仪器设备

超高压机  内蒙古包头市五十二所研制，压力范围0～800Mpa；高压介质  葵二酸二辛脂；FR-900型多功能薄膜封口机  上海麦尔多食品机械有限公司；TGL-220型冷冻离心机  上海安亭科学仪器厂；XW-80型旋涡混合器  上海医科大学仪器厂；SHP-60-60高压均质机  上海科学技术大学机电厂；Sartorious精密电子天平  北京塞多斯天平有限公司；818奥立龙酸度计 Orion Research Inc.USA； 微生物实验常规仪器。

1.5实验方法

1.5.1枯草芽孢杆菌的超高压处理

为了保证枯草芽孢杆菌营养体与芽孢稳定的比例，将其37℃，140rpm震荡培养约48h，营养体׃芽孢=1׃1。5000rpm离心15min，弃上清液，沉淀下的菌体用无菌生理盐水洗涤一次,再以Milk buffer制成菌悬液，调整细胞浓度，使起始菌数N₀为10⁹cfu•ml^-1，然后将其分装于5ml的无菌医用塑料瓶，热封口（不留顶隙）、冷藏备用。每一样品重复3次。高压容器的温度通过其夹套内恒温水浴来控制，将供试菌提前几分钟置于高压容器介质中，待样品温度与高压介质达到平衡后，进行超高压处理。处理后立即进行微生物计数。以同样的操作，取未经超高压处理的菌悬液作为对照。

1.5.2微生物数量测定

采用平板倾注计数法进行菌数的测定。以无菌milk buffer适当稀释超高压处理后的供试菌悬液，于营养肉汁琼脂平板37℃培养48h后，然后进行菌落记数。

1.5.3  响应曲面(RSM)实验设计

通过外界因子对超高压杀灭枯草芽孢杆菌效果的研究发现：压力，温度和保压时间是影响超高压杀灭枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）AS1.11731的关键因素，因此，在此基础上，本研究采用Box-Behnken模型，以压力，温度，保压时间3个外界因子为自变量（independent variable），分别以X₁、X₂、X₃来表示之，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程x_i=(X_i-X₀)/△X对自变量进行编码，其中，x_i为自变量的编码值，X_i为自变量的真实值，X₀为实验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长。超高压杀灭枯草芽孢杆菌的数量级Y为响应值（Y=-log₁₀ ^Nt/N0，即经超高压作用后枯草芽孢杆菌死亡的数量级，N_t为超高压处理后1ml菌液中的活菌数，N₀为对照1ml菌液中的活菌数），因子编码及水平见表1。假设由最小二乘法拟合的二次多项方程为：

Y=B₀++        (1)

上式中，n=3, 则方程（1）可转换为

Y=B₀+B₁x₁+B₂x₂+B₃x₃+B₁₂x₁x₂+B₁₃x₁x₃+B₂₃x₂x₃+B₁₁x₁²+B₂₂x₂²+B₃₃x₃²       （2）

其中Y=-log₁₀ ^Nt/N0，B₀为常数项，B₁, B₂, B₃分别为线性系数，B₁₂, B₁₃, B₂₃为交互项系数，B₁₁, B₂₂, B₃₃为二次项系数。为了求得此方程的各项系数，至少须17组实验来求解（见表2）。实验设计及结果见表2。利用统计软件Design Expert ( Static Made Easy, Minneapolis, MN,USA. version 6.0.5, 2001)来进行实验设计与数据分析。

表1 实验因素水平及编码

Table1.  Code and level of factors chosen for the trials

^a x₁=(X₁-45)/15;x₂=(X₂-400)/200;x₃=(X₃-15)/5

2结果和讨论

2.1 超高压杀灭枯草芽孢杆菌工艺优化

实验结果见表2

表2实验设计与结果表

Table2  Experimental designs and results