黑龙江省农业信息网

获得双价抗虫基因大豆转化植株

赵桂兰李望丰尹爱平

（吉林省农业科学院生物技术中心公主岭）

摘要 利用根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CPTI）和人工合成的GFM，CryIA B.t杀虫基因的双价抗虫基因植物表成载体pGBI 121S 4ABC用于栽培大豆品种“吉林35号”、“吉林43号”的转化。大豆未成熟子叶诱导的体细胞胚性愈伤组织经与农杆菌共培养，在筛选培养基上获得抗性胚性体，胚性体增殖的各阶段并萌发成可育转化植株，经PCR鉴定，GUS酶活性检测证实，外源抗虫基因存在于再生植株的细胞中。经连续3代抗虫测试结果表明，转基因大豆对大豆食心虫（soybean pod borer）幼虫具有较强的抗性。

关键词 大豆转化根瘤农杆菌抗虫基因

大豆食心虫在长江以北各大豆产区均有分布，以辽宁、吉林和黑龙江危害严重。该虫一年发生一代，专性滞育，以末令幼虫在土内作茧越冬。翌年7月下旬开始羽化为成虫迁飞至大豆地，交尾后次日产卵，卵孵化后的幼虫在豆荚上爬行寻找入荚部位而蛀荚；入荚前先在荚面上吐丝结成长形丝网，然后由此蛀入为害。大豆食心虫严重影响大豆的产量和质量。化学杀虫剂的使用不仅对人和动物有害，也造成环境污染，人们利用基因工程技术将外源苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫晶体蛋白转入大豆的研究近年有研究者报道^[1-3]。但由于害虫易对Bt毒蛋白产生耐受性已被研究者们所认识。豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea trypsin inhibitor,CPTI）属丝氨酸蛋白酶抑制剂，是一种天然的抗虫物质，具有抗虫谱广，对人、畜无副作用以及害虫不易产生耐受性等优点。其中杀虫机理在于抑制蛋白酶活性，阻碍害虫对蛋白质的消化，尤其是对鳞翅目害虫具有较强的抑制作用^[4^，5]。本文报道通过根瘤农杆菌介导法成功地将经过修饰的CPTI基因与人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫Bt晶体蛋白基因转入大豆，获得了再生植株，并对其进行了分子生物学鉴定。期望培育出更适合生产上需要的抗虫新型材料。

1 材料和方法

1.1 供试受体材料

转化受体以栽培大豆（Glycine Max (L.)品种“吉林30、吉林35、吉林36、吉林43、吉林47号”的幼胚子叶为实验材料。

1.2 菌种和质粒

根瘤农杆菌LBA 4404，携带的质粒pGBI121S4ABC为中国农业科学院生物技术中心郭三堆先生提供。载体中用于提高目的基因转录和翻译的调控无件包括增强子序列，35S启动子、Ω序列、多联终止密码子、正确切割加工序列、Poly(A)序列及Nos终止子。该载体中还带有卡那霉素抗性选择标记基因和GUS报告基因^[6]。

1.3 农杆菌的培养及制备

从4℃保存的平板上取单菌落，接入10ml YEB液体培养基+50ml /L Kan中，26℃，160r/min振荡培养过夜，取2ml的菌液至50mlYEB液体培养基再振荡培养至对数期，OD₆₀₀= 0.4-0.6，将菌液离心、收集菌体后用30ml MSO液体培养基将菌体悬浮做为农杆菌转化的工程菌液。

1.4 外植体与农杆菌侵染过程

取开花后25天左右的幼荚，幼胚子叶离体培养10d后，形成有体细胞胚发生能力的愈伤组织^[7]，将其浸入制备好的工程菌液中5分钟，再取出侵菌后的外植体置入无菌滤纸上，吸掉多余的菌液，转至共培养基中共培养3d后再转入筛选培养基每二周继代一次，继代3次后，获得的抗性胚体逐渐发育，分离成单个的不同阶段的胚体。子叶胚在G70培养基上萌发抗性植株。

1.5 GUS的组织化学检测

依照Jefferson(1987)的方法^[8]，将经过筛选存活下来的胚体、增殖至个体胚阶段的抗性转化体放入X-Gluc染色后，37℃保温、过夜，70%乙醇脱色，在解剖镜下观察。

1.6 PCR扩赠鉴定

采用CATB法提取转化植株和对照植株叶片DNA，进行PCR检测。PCR鉴定采用常规方法进行，所使用引物为：5’端引物：

P₁5’-CCT，GTC，GAG，CCA，GAA，CTG，TT-3’(20bp)

P₂5’-CCT，TGA，CTG，TCT，TGG，CGT，TGC-3'（21bp）。

1.7 转基因大豆抗虫测试

在田间扣笼鉴定转Bt基因的2个T3代株系，进行接虫鉴定，每棚610头蛾（雌、雄蛾按1:1比例）放入扣笼。同时以未转基因品种为对照，在按虫后调查卵荚、入荚死亡率以及成熟后调查单株虫食率。

2 结果与分析

2.1选择压的实验

不同浓度的Kan（0，5，25，50，75，100mg/L）分别用于大豆胚性愈伤组织生长及个体胚发育阶段的抑制实验。（见图2、图3）接种生长一致的胚性愈伤1.0g，每个处理5个重复。

接种生长发育基本一致的子叶型胚10个/皿（5

上述试验表明25-50mg/L的Kan浓度对大豆的愈伤及胚状体均可达到近50%的抑制作用。特别是在Kan的浓度为50mg/L时，个体胚体的生存率相对低下（18%），抑制了胚状体的发育及分化。两个试验虽有个体差异，可能是供试外植体发育时期不同，前一个试验是测量胚性愈伤生长量，新增殖的愈伤是在筛选培养基的上部，直接接受选择的时间相对晚些，而单个胚状体是直接接受选择压的筛选，且外植体小。故此，在Kan 50ml/L上进行筛选时胚状体生存率相对低些。笔者认为，二个试验结果基本吻合。依据不同外植体的生理指标来确定Kan抗性的临界浓度，方能达到筛选的目的，降低假转化体的逃逸。

2.2外植体转化的最佳时期

离体培养3-10d的幼胚子叶形成的愈伤组织的幼胚子叶均做了农杆菌侵染试验，当离体培养两周以上的幼胚子叶，形成了愈伤组织表面已产生肉眼可见的球形胚体，此阶段用于转化实验，造成嵌合体的机率会高。以培养6-10d间的幼胚子叶做为农杆菌侵染的受体外植体，将外植体上轻划几道伤口，共培养后转至Kan 50mg/L的筛选培养基上，幼胚子叶缓慢变褐，在变褐过程中，有部分胚体开始增殖，待体胚发育至个体胚的不同阶段后，转至增殖、成熟、萌发培养基上，即可获得再生完整的小植株，小植株移栽后发育成可育转基因植株。

2.3 转化植株GUS酶活性测定

为了进一步测定农杆菌介导法对大豆幼胚子叶的转化效率和外源目的基因的稳定表达效果，对在筛选培养基上增殖的各阶段抗性转化体（胚状体，苗期根）进行了GUS检测，增殖的胚状体经GUS染色，转化体全部为兰色，在抗性植株的根中也看到了很强的兰色反应。而非转基因胚体和植株的根中未有兰色。

2.4 PCR检测分析

用CATB法提取和纯化再生植株叶片总DNA，以其为模板，分别用NPTⅡ基因的5’端和3’引物进行PCR扩增，在随机选取12株抗性植株中，有6株可扩增到与质粒扩增产物相同的片段。而未转化的对照植株没有扩增出上述片段。由此看出，Bt基因已存在于转化植株的基因组中。

2.5 转基因植株的抗虫测定

田间自然测试和扣笼单株接蛾鉴定（按食心虫大发生年份测试）。将转基因大豆2个株系的T₃代种子各分二个重复，调查食心虫对种子的损失程度及成熟后虫食粒率与非转基因品种的比较差数。结果表明，两份转基因材料的抗虫性都比各自的对照材料高出2个数量级。如T 1-20为抗（R）、1-20CK为感（S）、T 0-221；1-8为高抗（HR）、0-221CK为抗（R）。

结论：

通过对农杆菌介导大豆幼胚子叶导入目的基因已在大豆雄性不育基因（Barnase）、甜素碱醛脱氢酶基因（BADH）^[9^，10]的转化上获得转基因植株。认为大豆体细胞胚发生再生系统是理想的转化系统，该系统诱导的胚性细胞及胚状体发育成植株起源于单细胞，而且在侵染阶段的外植体的发育时期是体细胞进入分裂的高峰期（我们已做了组织结构观察，将另文发表），转化功能细胞多，即处于转化感受态的细胞数量多。该时期导入外源目的基因转化效率高，转基因植株嵌合体少。由于转化细胞由体胚发生途径再生，胚的结构完整（根茎叶）成苗快、数量多、重复性好，变异性小，有利于转基因后代材料的遗传稳定性分析。关于Kan对大豆的敏感性问题，不同基因型之间，不同外植体之间的差异很大，研究者在试验前一定要筛选出最佳值，不能照搬他人方法。

参考文献

1. Steward C.N.Adang M.J, All J.N,Boerma H.R,et all ,Genetic transformation recovery and characterization of Bacillus thuringiensis CrylAc gene. Plant Physiol,1996,112:121-129.

2. 徐香玲,高晶等. Ti质粒介导的B.t.k –δ内毒素蛋白基因转化大豆的初步研究。《大豆科学》1997.16（1）：9-11

3. 苏彦辉、王慧丽等. 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因导入大豆的研究。《植株学报》1999，41（10）：1046-1051.

4. Song S I,Kim C H, Baek S T, Choi Y D. Nucleotide Sequences of cDNAS encoding the precursors for soybean (Glycine max).Plant Physiol, 1993,101:1401-1402.

5. Gatehouse A M R, Shi Y, Powell K S. Approaches to insect resistance using transgeneic plants philos Trans R Soc Lond B,1993, 342: 279-286.

6. 崔洪志，郭三堆双价杀虫基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达，《农业生物技术学报》，1998，6（1）7-13.

7. 刘艳芝、赵桂兰等，大豆幼胚子叶诱导胚胎发生，吉林农业科学，1999，24（6）：16-18

8. Jefferson, R,A., 1987, Assaying Chimeric genes in plants the gus fusion system. Plant Mol. Biol. Rep.5:389-405

9. 刘艳芝、赵桂兰等，农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化大豆的初步研究。《东北师大学报》2000，11：49-51

10. 赵桂兰、刘艳兰等.影响农杆菌介导的大豆基因转化因素的研究《大豆科学》

2001，20：（2）84-88.

国家作物委员会大豆专业委员会 黑龙江省农业信息中心

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　国家作物委员会大豆专业委员会
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　黑龙江省农业信息中心