油豆角分子聚合育种技术规程

1　范围

本标准规定了油豆角分子聚合育种的定义、仪器、试剂、目的基因的标记、分子聚合技术。

本标准适用于油豆角分子聚合育种。

2　定义

分子聚合育种

通过传统杂交、回交、复交技术将有利基因聚合到同一个基因组，在分离世代中通过分子标记选择含有多个目标基因的单株，从中再选出农艺性状优良的单株，实现有利基因的聚合。

3　仪器

3.1　PCR仪

3.2　低温高速离心机

3.3　稳压稳流电泳仪、垂直板电泳系统

3.4　常温、低温冰箱

3.5　紫外凝胶成像系统

3.6　微量移液器

4　试剂

4.1　常规试剂

4.1.1　DNA提取缓冲液，见附录A1

4.1.2　6%聚丙烯酰胺凝胶，见附录A2

4.1.3　10×TBE缓冲液贮液，见附录A3

4.1.4　5×TBE溶液，见附录A4

4.1.5　载样缓冲液，见附录A5

4.1.6　过硫酸铵贮液，见附录A6

4.1.7　硝酸银溶液，见附录A7

4.1.8　硫代硫酸钠溶液，见附录A8

4.1.9　2%Repel溶液，见附录A9

4.2　DNA Marker：DL2000

4.3　菜豆SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）引物，见附录B

5　目的基因的分子标记

5.1　RIL群体的建立

5.1.1　亲本的选择

选配组合时父母本应带有标记性状，如：紫色下胚轴对绿色下胚轴、紫色花对白色花。以携带有抗病基因的油豆角品种为父本，以不具有任何抗病基因的、高产的油豆角品种为母本。

5.1.2　杂交授粉

5.1.2.1　母本去雄法

在开花前1d～2d，即花粉未散出来，花蕾已伸出花萼之外，花瓣转色时，用镊子拨开旗瓣和翼瓣，撕去龙骨瓣先端，使柱头和花粉露出，仔细去除10枚雄蕊，用带花粉的父本毛刷状柱头涂抹母本柱头授粉。然后使龙骨瓣、旗瓣和翼瓣恢复原状，挂上标签作为标记。

5.1.2.2　母本不去雄法

在开花前1d～2d，用镊子尖拨开旗瓣和翼瓣，向后方轻拉两翼瓣，使柱头从龙骨露出，用带花粉的父本毛刷状柱头涂抹母本柱头授粉。然后使龙骨瓣、旗瓣和翼瓣恢复原状，挂上标签作为标记。

5.1.3　F₂ ～F₆ 世代自交

油豆角自交自然完成，选取单株挂上标签作为标记。

5.1.4　采种

油豆角人工授粉后30d～40d采收。杂交一代（F₁）混收，从杂交二代（F₂）开始单株采收。

5.1.5　RIL（重组自交系）群体的构建

从杂交二代（F₂）开始采取单粒传的方法自交6代，建立RIL群体。

5.2　目的基因的分子标记

5.2.1　DNA提取

a)     取100mg 新鲜幼叶，置1.5ml的离心管中加入液氮研磨成粉。

b)     加入提取缓冲液900μl 轻轻混匀。

c)     加入10％SDS100μl，充分混匀，于65℃水浴中保温60min（间或晃动1次）。

d)     加入5mol／L乙酸钾160μl，充分混匀，冰浴中放置30min。

e)     4℃下12000r/min离心15min。

f)     上清液转入新离心管中，加入等体积的酚/氯仿，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻。

g)     于4℃下8000r/min离心10min。（重复二次）

h)     上清液转入新离心管中，加入等体积氯仿／异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻。

i)     于4℃下8000r/min离心10min。

j)     转移并量出上清液体积，置新离心管中，加入1／5倍体积的3mol／L NaAC，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，-20℃放置数分钟。

k)     10000r/min离心5min～10min，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液。

l)     用80％乙醇洗涤沉淀2～3次，吹干。

m)     加入40 μl TE或dH₂0溶解DNA，备用。

5.2.2　PCR（聚合酶链式反应）扩增

反应体系（20 μl ）见表1

表1　 

反应程序见表2

表2　 

5.2.3　聚丙烯酰胺凝胶电泳

将PCR反应后的SSR材料每管加上10?l Loading Buffer（在PCR板上），上面覆盖甘油，置于PCR仪中变性10min，取出，放入冰水混合物中冷却。冷却后放入4℃冰箱里保存，待用。

5.2.3.1　制备6%聚丙烯酰胺凝胶。

5.2.3.2　用微量移液器取10?l左右的Loading Buffer，隔一定距离点少许。然后开动电泳仪，开始预电泳30mins。

5.2.3.3　用微量移液器取4.0?l电泳材料的样品，点入点样孔内，待所有的材料点完样后，开始电泳，恒功率100W电泳90min。

5.2.3.4　银染

a)     固定：下板后，把玻璃板放入固定液中固定20min（固定液：冰醋酸100ml＋900ml                  蒸馏水）。

b)     水洗：把固定液中的玻璃板取出，放入蒸馏水中，水洗10min。

c)     银染：把水洗后的玻璃板放入银染液中染色20－30min。（银染液：1000ml蒸馏水＋硝酸银溶液1000?l＋甲醛溶液1500?l）。

d)     水洗：蒸馏水水洗5－6 sec。

e)     显影：于上步的水洗槽中把玻璃板迅速取出，放入显影液中，开始显影。（蒸馏水1000m1＋无水碳酸钠30g＋硫代硫酸钠溶液200?l）。

f)     固定：待影像清晰后，取出玻璃板，放入固定液中，停止显影。把显影液倒掉。

g)     水洗，风干：用蒸馏水洗去酸味，然后置于通风处风干，留待统计。

5.2.4　SSR标记数据统计分析

5.2.4.1　SSR带型的统计方法

选取在父母本间具有扩增多态性的引物对RIL群体进行分析，根据条带在群体中的分离情况，将有母本类型条带的个体记为“A”,有父本类型条带的个体记为“B”，杂合的和缺失不清的记为“-”。在Microsoft Excel 2000上，分别建立RIL作图群体300个单株的SSR标记基因型数据库。

5.2.4.2　统计分析

用x²测验检测各标记基因型分离比是否符合1:2:1，并对群体基因频率进行正态分布检验。

5.2.5　数据处理与图谱制作

5.2.5.1　构建SSR图谱

使用遗传连锁分析和遗传图谱构建软件MAPMAKER/EXP version3.0b 进行数据处理和分析。该软件可从以下网址获得：

http://www-genome.wi.mit.edu/genome-software

或ftp://ftp-genome.wi.mit.edu/distributions/software/mapmaker3

5.2.5.2　QTL（数量性状位点）定位和效应分析

利用Windows QTL Cartographer V2.0 进行复合区间作图扫描农艺性状的QTLs ，以似然比LR （Likehood Ratio ）大于11.5 ，即对应LOD 值大于2.5 作为QTLs 存在的阈值。利用MapChart 2.1 版本绘制连锁图谱。用于分子聚合育种的分子标记与目的基因的距离应在5cM以内，鉴定出的主效QTL遗传贡献率在10%以上。

5.2.6　DNA分子标记在后代的验证

与目的基因共分离或紧密连锁的DNA分子标记在F₅代以上进行验证，保证该分子标记稳定遗传。

5.2.7　DNA分子标记在各生态环境下的验证

与目的基因共分离或紧密连锁的DNA分子标记在在各生态环境下进行验证，消除环境噪音。

6　分子聚合技术

6.1　配制复合杂交组合

例：(高产×抗₁)F₁×抗₂，同时利用不含任何抗性基因的油豆角品种做对照。

6.2　复合杂交后代的选择

对复合杂交组合的F₁、F₂代，进行抗性接种鉴定，淘汰感病株，保留抗病株继续种植，

对F₃代进行抗性鉴定并利用筛选到的与抗病基因紧密连锁的标记，对抗病单株进行分子标记辅助选择。

6.3　筛选出含有多抗性基因的单株

例：含有抗₁＋抗＋抗……等基因的植株。

6.4　培育高产、优质、多抗的油豆角新品种

对聚合体后代进行农艺性状调查，进一步参加区域实验和生产实验培育出高产、优质、多抗的油豆角新品种。

7　油豆角分子聚合技术流程

图1　 

附　录　A
（规范性附录）
主要试剂配制

A．1  DNA提取缓冲液

1M  Tris-HCl   pH 8.0  1000ml。

称取121.14g Tris 溶于800 ml水中，再加入42 ml 37%浓盐酸，调pH值至8.0，定容至1000ml。

0.5M  EDTA   pH 8.0  1000ml。

186.12g EDTA 溶于800 ml水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml。

10%  SDS    1000ml。

100g SDS 溶于800 ml水中，定容至1000ml。

5M  NaCl    1000ml。

292.2g NaCl 溶于800 ml水中，定容至1000ml。

5M  KAc    500ml。

245 g  KAc  溶于350 ml水中，定容至500ml。

表3  SDS 提取液

A．2  6%聚丙烯酰胺凝胶

A．3  10×TBE溶液

A．4  5×TBE溶液

A．5  Loading Buffer

A．6  APS溶液

A．7  硝酸银溶液