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前 言
本标准在制定过程中，经过调查研究、参考有关资料和分析实验结果，规定了马铃薯环腐病田间检测方法和三种室内检测方法。
本标准的附录A和附录B为资料性附录。
本标准由黑龙江省农业委员会提出。
本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所（农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨)）。
本标准主要起草人：王晓丹、郭梅、胡林双、闵凡祥、魏琪、董学志、马纪、李学湛。
本标准系首次发布。
马铃薯环腐病检测方法
1 范围
本标准规定了马铃薯环腐病检测方法。
本标准适用于马铃薯植株和块茎的环腐病田间和室内检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 7331-2003 马铃薯种薯产地检疫规程
GB 8855 新鲜水果和蔬菜的取样方法
3 检测方法
3.1 田间检测方法
3.1.1 原理
马铃薯环腐病菌引起的主要症状特征是本检测方法的依据。
3.1.2 田间检测抽样
抽样标准按照GB 7331-2003中5.1.1.2规定的调查方法执行。
3.1.3 马铃薯环腐病田间症状
3.1.3.1 植株：分为枯斑和萎蔫两种类型。枯斑型多在植株基部复叶的顶叶先发病，叶尖和叶缘及叶脉呈绿色，叶肉为黄绿或灰绿色，具明显斑驳，且叶尖干枯或向内纵卷，病情严重时向上扩展，致全株枯死；萎蔫型初期则从顶端复叶开始萎蔫，叶缘稍内卷，似缺水状，病情严重时向下扩展，全株叶片开始褪绿，内卷下垂，终致植株倒伏枯死。当横切植株茎基部时，可见维管束呈浅黄色或黄褐色，有乳状物溢出。
3.1.3.2 块茎：感病块茎维管束软化，呈淡黄色，切开后可见维管束变为乳黄色至黑褐色，皮层内出现环形或弧形坏死部分。发病严重的块茎挤压时，维管束部分与薯肉分离，组织崩溃呈颗粒状，并有乳黄色菌浓溢出。经贮藏，块茎芽眼变黑干枯或外表爆裂，播种后不出芽或出芽后枯死或形成病株。
3.1.4 检测结果
根据马铃薯植株或块茎上的症状，目测判定马铃薯环腐病，并计数，确定样点内病株/病薯率。
3.2 室内检测方法
样品的取样方法按照GB 8855中规定的取样一般要求执行，室内检测所用的水按照GB 6682中规定的三级水要求执行。本标准提供了三种室内检测方法，可根据实际情况任选其中之一。
3.2.1 革兰氏染色
3.2.1.1 原理
马铃薯环腐菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Davis et al.）为革兰氏阳性菌，革兰氏染色后镜检,菌体呈蓝紫色。将革兰氏染色涂片在显微镜10×100倍及油镜下观察，菌体为棒杆状，通常长为0.8μm～1.2μm，宽为0.4μm～0.6μm，单个存在，偶尔成双，间或出现“V”、“L”、“Y”形连接，以此判断马铃薯环腐病菌。
3.2.1.2 试剂
结晶紫（又称龙胆紫）染色液，碳酸氢钠，碘，氢氧化钠，丙酮，95%乙醇，碱性品红，70%酒精溶液，香柏油，二甲苯。
3.2.1.3 操作步骤
3.2.1.3.1 试剂配制
见附录A
3.2.1.3.2 试样制备
见附录A
3.2.1.3.3 测定步骤
——染色：滴1滴结晶紫染色液与碳酸氢钠溶液等量混合（现用现配）于载玻片上，染色20s。
——媒染：滴1滴碘媒染液于上述玻片上媒染20s，滴水洗涤。
——脱色：脱色剂脱色5～10s，滴水洗涤。
——复染：滴1滴碱性品红复染液复染2～3s，滴水洗涤，风干。
——镜检: 用显微镜在10×40倍和10×100倍下镜检复染后的涂片，并以经革兰氏染色的标准阳性环腐病菌为对照。
3.2.1.4 结果判定
镜下的菌体颜色若为蓝紫色，加1滴香柏油于10×100倍下镜检，观察菌体形态，与标准菌株形态一致的则为革兰氏阳性菌，判定是马铃薯环腐病菌，形态不一致的判定不是马铃薯环腐病菌；菌体若为粉红色，则为革兰氏阴性菌，判定不是马铃薯环腐病菌。
3.2.2 双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)
3.2.2.1 原理
见附录B
3.2.2.2 仪器设备
酶标仪、微量移液器、恒温振荡培养箱、不同规格的量筒、烧杯、容量瓶等。
3.2.2.3 操作过程
——将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
——加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
——加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
——加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
3.2.2.4 结果判定
用酶标仪在波长405nm处测定各滴定孔内的吸光值。
3.2.3 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定法（NCM-ELISA）
3.2.3.1 原理
见附录B
3.2.3.2 仪器设备
酶标仪、微量移液器、恒温振荡培养箱、不同规格的量筒、烧杯、容量瓶等。
3.2.3.3 操作过程
——富集培养 将受检样品提取液与富集培养基混合，20～23℃轻摇状态下孵育48小时。
注： 富集培养过程适合于检测潜在感染病菌的植株或薯块；若感病植株或薯块发病阶段已处于中期或后期，富集培养过程可选做。
——点样 将硝酸纤维素膜加入受检样品，室温孵育。样品中的抗原与固相支持物结合，加入封闭缓冲液，室温下孵育。
——加特异性抗血清，形成抗原抗体复合物将膜缓慢放入封闭缓冲液中，轻摇状态下室温孵育。
——加酶标抗体，保温反应固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
——加底物显色 固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知样本中抗原的量。
3.2.3.4 结果判定
阳性样品使酶反应呈有色产物，颜色深浅强度的变化范围取决于样品中菌浓度的大小，因此，根据
阳性对照条中不同浓度菌所表现颜色深浅的不同，可判断受检样品是否感染环腐病菌及菌浓度。
注： 利用上述两种酶联免疫法检测马铃薯环腐病菌过程中，所用缓冲液及提取液可按照检测试剂盒的说明书进行配置和使用。
附 录 A
（规范性附录）
革兰氏染色
A.1 试剂配制
A.1.1 结晶紫（又称龙胆紫）染色液
称取结晶紫2.5g溶于少量水中，定容至1000mL。
A.1.2 碳酸氢钠溶液
称取12.5g碳酸氢钠（NaHCO3）,溶解并定容至1000mL。
A.1.3 碘媒染液
称取2g碘溶解于10mL 1M氢氧化钠（NaOH）溶液中，加水定容至100mL。
A.1.4 脱色剂
量取25mL丙酮(CH3COCH3)，加95%乙醇(CH3CH2OH)定容至100mL。
A.1.5 碱性品红复染液
取100mL碱性品红95%乙醇(CH3CH2OH)饱和液，加水定容至1000mL。
A.2 试样制备
A.2.1 植株
方法一，从地表上方2cm处割断，用镊子从切口挤出汁液，滴1滴于载玻片上，风干后，用酒精灯火焰烘烤2—3次固定。
方法二，从切口一端切下0.5cm厚茎片，在小研钵中研磨，吸取1滴汁液滴于载玻片上，风干后，用酒精灯火焰烘烤2—3次固定。
A.2.2 块茎
切开块茎，如维管束处变色或腐烂，用镊子压挤，滴1滴渗出物于载玻片上，加1滴无菌水稀释，风干后，用酒精灯火焰烘烤2—3次固定。如无渗出物，用镊子从维管束附近取出一些碎组织放在载玻片上，加1滴无菌水压挤混匀，移掉碎组织。风干后，用酒精灯火焰烘烤2—3次固定。
附 录 B
(规范性附录)
酶联免疫吸附测定法
B.1 原理
B.1.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)
双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(Double Antibody Sandwich-E L ISA,DAS-ELISA),是利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质的OD值，即可确定待测抗原含量。
B.1.2 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定法（NCM-ELISA）
硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay on Nitrocellulose Membranes, NCM-ELISA）是以硝酸纤维素膜取代微量滴定板作为样品和试剂的支持物，其原理是：细菌抗血清可与预先吸附在硝酸纤维素膜上的病原细菌特异结合,而带有标记物的抗抗体又可与细菌抗血清特异结合，当加入与抗抗体标记物相应的底物后，就可通过底物与标记物反应所表现出的特征来判断待检样品是否染有该细菌。
附 录 C
（资料性附录）
马铃薯环腐病的植株与块茎田间典型症状
图 1 马铃薯叶片感染环腐病菌的症状
图 2 马铃薯块茎感染环腐病菌的症状
图 3 马铃薯植株感染环腐病菌的症状
附 录 D
（资料性附录）
马铃薯环腐病菌室内检测结果示例
图 4 马铃薯环腐病菌革兰氏染色阳性菌形态
图5马铃薯环腐病菌NCM-ELISA检测结果示例
图 6马铃薯环腐病菌DAS-ELISA检测结果示例
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