前 言
本标准附录A为规范性附录。
本标准由黑龙江省农业委员会提出。
本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所（农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨））。
本标准主要起草人：白艳菊、李学湛、于德才、吕典秋、范国权、耿宏伟、高艳铃、王文重、张威、张抒。
引 言
长期以来黑龙江省一直是马铃薯生产重要省份，也是中国种薯输出的主要省份之一，马铃薯除了具有粮菜兼作的特点，其显著的经济附加值受到更普遍的重视，不同马铃薯品种特性具有不同的生产应用价值，那么，明确了解马铃薯品种的纯度和特性对于其在应用中更好的发挥品种优势具有重要作用。本标准采用DNA指纹分析法进行马铃薯品种鉴定，有效解决马铃薯品种混杂和品种鉴定等问题，对于马铃薯生产、加工、育种、常规检验、仲裁检验、质量评价、销售以及种子资源保护等都具有非常重要的实际意义。
马铃薯品种PCR鉴定方法
1 范围
本标准规定了利用PCR方法鉴定马铃薯品种。
本标准适用于马铃薯品种的鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB 7331 马铃薯种薯产地检疫规程
GB 18133 马铃薯脱毒种薯
3 仪器
a) PCR仪；
b) 低温高速离心机(≥12,000g)；
c) 稳压稳流电泳仪、垂直板电泳系统；
d) 冰箱、超低温冰箱；
e) 紫外灯或紫外凝胶成像仪；
f) 微量移液器（0.1~2μL、0.5~10μL、10~100μL、20~200μL、100~1000μL）；
g) 恒温水浴锅（37℃~95℃）；
h) 制冰机。
4 试剂
4.1 常规试剂
4.1.1 TE缓冲液（pH8.0）见附录A.1
4.1.2 样品提取缓冲液见附录A.2
4.1.3 24：1氯仿/异戊醇混合液见附录A.3
4.1.4 异丙醇
4.1.5 70%酒精
4.1.6 Taq DNA聚合酶（5u/μL），严格按照说明书保存
4.1.7 0.1M DTT
4.1.8 四甲基乙二胺（CH3N（CH2）2NCH3）
4.1.9 30%丙烯酰胺贮液见附录A.4
4.1.10 过硫酸铵贮液见附录A.5
4.1.11 10×TBE缓冲液贮液见附录A.6，使用时将其用蒸馏水稀释成1×TBE使用缓冲液
4.1.12 8%聚丙烯酰胺凝胶见附录A.7
4.1.13 溴化乙锭（Ethidium Bromide 简称EB）（10μg/μL）见附录A.8
4.1.14 载样缓冲液见附录A.9
4.1.15 5mM dNTPs见附录A.10
4.1.16 10×PCR 缓冲液见附录A.11
4.1.17 DNA Ladder Marker：100bp~1500bp
4.2 引物
表1 马铃薯品种鉴定引物序列
|
引物 |
序列（5’到3’） |
贮存浓度（μM） |
|
SSI-F |
TCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AAC |
3 |
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SSI-R |
TCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGA |
3 |
|
Patatin-F |
CAA CCA ACA AGG TAA ATG GTA CC |
6 |
|
Patatin-R |
TGG TCT GGT GCA TTA GAA AAA A |
6 |
|
STM0014-F |
CAG TCT TCA GCC CAT AGG |
3.6 |
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STM0014-R |
TAA ACA ATG GTA GAC AAG ACA AA |
3.6 |
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UGP-F |
GAA ACT GCT GCC GGT GC |
8 |
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UGPM-R |
CAA TGG GGT TCC ATC AAA C |
8 |
5 实验条件
5.1 避免样品污染
DNA的提取及PCR扩增所使用的微量移液器为分子检测专用，主要耗材（1.5mL、0.5mL离心管，PCR管，与微量移液器配套的枪头）需要灭菌，试剂要防止污染。
5.2 个人防护和环境保护
电泳中的EB可诱发基因突变，操作人员在操作过程中需佩戴手套和口罩，电泳后的凝胶，以及被EB污染的物品要依据EB使用说明进行处理。
6 操作程序
6.1 样品的采集和处理
检测材料可以是大田马铃薯叶片、休眠块茎、试管苗或芽。
田间样品采集按照GB 18133 和GB 73311中要求随机采集叶片，登记编号，利用冰盒携带，4℃条件下保存。块茎和芽样品采集后，4℃条件下保存。试管苗提取前不开封，防止污染。
样品在4℃条件下可保存2周，在-20℃条件下可保存6个月，在-70℃条件下可保存2年。
设标样，与样品同时处理。
6.2 标样
6.2.1 对于已知品种鉴定或纯度鉴定，标样为该已知品种。
6.2.2 对于未知品种鉴定，随机选择品种作标样。
6.3 DNA提取(改良的CTAB方法)
6.3.1 取1g样品用液氮充分研磨，加3mL样品提取缓冲液，轻柔颠倒4次~6次混匀，65℃水浴30min，期间轻柔颠倒2次~3次。
6.3.2 冷至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻缓颠倒混匀，室温放15 min，6000g离心20min。
6.3.3 小心收集转移上清液于另一离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15 min。
6.3.4 14 000g 离心15 min，去上清液。
6.3.5 用500μL 70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下干燥，溶于50μLTE缓冲液中，利用紫外分光光度计对所提取的DNA纯度(OD260/OD280≈1.8)及浓度(OD260×稀释倍数×50/1000μg/μL)进行确定，并用TE缓冲液将其定容为0.08μg/μL，-20℃存放备用。
6.4 PCR扩增
6.4.1 反应体系
10×PCR 缓冲液 2μL
5mMdNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTPs) 1.6μL
贮存浓度的引物 各1μL 共8μL
Taq DNA聚合酶（5u/μL） 0.15μL
模板DNA 1μL
灭菌双蒸水 7.25μL
总体系 20μL
先从灭菌双蒸水加起，然后按顺序加入上述成份，轻柔颠倒4次~6次混匀，瞬时离心。对于多个样品，可以将混合液配好后，混匀，分装到PCR管中，最后加入模板DNA。
6.4.2 PCR反应条件
6.4.2.1 95℃变性 5min
6.4.2.2 35个循环：94℃变性30s，48.5℃退火45s，72℃延伸1min 40s
6.4.2.3 72℃延伸 7min
6.4.2.4 4℃保存
6.5 电泳
6.5.1 制备8%聚丙烯酰胺凝胶，见附录A.6。
6.5.2 取5μL PCR产物与1μL载样缓冲液混合，加入到8%聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中。
6.5.3 取5μL DNA Marker，加入到8%聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中。
6.5.4 在1×TBE使用缓冲液中以290v/cm电压电泳约3h，当指示剂距底部1cm时停止电泳。
6.6 染色
染色液0.5μg/mL EB，染色1h，用清水洗去染色液，每次洗15min，共洗２次。
6.7 观察
利用紫外灯或紫外凝胶成像仪观察PCR扩增的DNA带，并拍照。
7 结果判定
7.1 利用紫外灯或紫外凝胶成像仪观察PCR扩增的DNA带。
7.2 与DNA Marker进行比较分析。
7.3 读出12-14条主要的DNA带，比较其带的差异。
7.4 对于已知品种鉴定或纯度分析，设该品种为标样，进行比较。
7.5 对于未知品种鉴定，首先找出相似品种归类，设与之相近的某品种为标样1，在同一块凝胶板上与相近的标样1相比较，再根据比较情况从已知品种资源库上找出最接近品种，再在另一块凝胶板上将最接近品种设为标样2，与该未知品种图谱相比较，依此方法经多次图谱比较从品种资源库中鉴定出该品种。
附 录 A
（规范性附录）
主要试剂配制
A.1 TE缓冲液（pH 8.0）
称取Tris 1.21g，EDTA 0.298g，先加入少量灭菌双蒸水溶解，用HCl调pH值至8.0，用灭菌双蒸水定容至200mL。
A.2 样品提取缓冲液（100mL）
称取CTAB 1.5g，NaCl 8.18g，EDTA 0.584g，Tris 1.21g，先加入少量灭菌双蒸水溶解，加入β-巯基乙醇最终浓度为20 mM/L，用HCl调pH值至8.0，用灭菌双蒸水定容至100mL。
A.3 24：1氯仿/异戊醇混合液
量取氯仿 24mL，异戊醇 1mL，混匀。
A.4 30%丙烯酰胺贮液（100mL）
称取丙烯酰胺 29g，甲叉双丙烯酰胺 1g，在37℃下溶于少量灭菌双蒸水中，用灭菌双蒸水定容至100mL ，4℃保存。
A.5 过硫酸铵贮液
称取硫酸铵1.0g，溶于4.5mL灭菌双蒸水中，4℃保存。
A.6 10×TBE缓冲液贮液
称取Tris 107.8g，硼酸 55.0g，EDTA 9.3g，先加入少量蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至1000mL。
A.7 8%聚丙烯酰胺凝胶
量取30%丙烯酰胺贮液 4mL，10×TBE缓冲液贮液 5mL，四甲基乙二胺 50μL，灭菌双蒸水 50mL，混匀，制凝胶前加过硫酸胺贮液100μL，混匀，马上灌胶。
A.8 EB（10μg/μL）
称取EB 20mg，用20mL灭菌双蒸水溶解。
A.9 载样缓冲液
称取二甲苯兰 100mg，溴酚兰 100mg，蔗糖 40g，量取10×TBE缓冲液贮液 10mL 溶解，用灭菌双蒸水定容至100 mL。
A.10 5 mMdNTPs
内含浓度为20mM/L的dCTP、dTTP、dGTP、dATP各20μL。
A.11 10×PCR缓冲液
量取1M Tris-HCl (pH8.3) 10mL，1M KCl 50mL，Nonidet P40 0.8mL，1.5M MgCl2 1mL，用灭菌双蒸水定容至100mL。
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